Введение в физику белка (стр. 56 )

 

  Структура N-концевого домена интерферона  —  одна из первых, более или менее успешно предсказанных до опыта структур белковых молекул.

  Хочу подчеркнуть факторы, способствовавшие успеху предсказания: a-спирали предсказаны здесь очень уверенно; и они одинаково расположены в отдаленно-гомологичных цепях, что позволяет им доверять.
  Однако столь уверенное и повторяющееся в гомологах предсказание вторичной структуры встречается на практике не часто. Более типичны некоторые разночтения, как в С-концевом домене интерферонов (Рис.19-10), для которого  —  именно вследствие этого, очень типичного небольшого разночтения  —  однозначного предсказания укладки цепи получить не удалось.
  И еще очень важная вещь для успеха предсказания строения интерферона. Когда мы искали наилучшую упаковку предсказанных a-спиралей, мы могли рационально организовать перебор всех возможных упаковок, так как располагали априорной классификацией a-спиральных комплексов (я об этом уже говорил)  —  она как раз была разработана к тому времени Мурзиным и мной.

  Вернемся к предсказанию вторичной структуры.
  Оно носит вероятностный характер: точность распознавания a-, b-структуры и нерегулярных петель белка по его аминокислотной последовательности составляет около 65%.
  Можно ли улучшить предсказание вторичной структуры? Да. В методе "PHD" Роста и Сандера (очень его рекомендую, он доступен по Интернет) вторичная структура предсказывается не для одной аминокислотной последовательности, а для набора гомологов. В результате такого подхода случайные погрешности как бы сглаживаются и предсказание становится намного более точным (достигая, в среднем, 72-73% вместо 63-65%).
  Итак  —  несмотря на свою ограниченную точность, предсказание вторичной структуры стало уже, по сути, рутинной процедурой исследования первичной структуры белка.

  Перейдем теперь к новой, быстро развивающейся области  —  к работам по предсказанию пространственных укладок белковых цепей.

  Проблему предсказания белковой структуры можно представить себе как проблему выбора той структуры, которая наиболее стабильна для данной аминокислотной последовательности. Проблема заключается в том, откуда взять "возможные белковые структуры". Самый простой, прагматичный ответ  —  взять из Банка Белковых Структур. Там, конечно, нет еще всех возможных структур  —  но есть надежда, что там есть примерно половина всех существующих в природе мотивов укладки белковых цепей в домены. Эту надежда  —  ее обосновал Сайрус Чотиа  —  основана на том, что вновь расшифровываемые белки (точнее  —  их домены) все чаще и чаще оказываются похожими на уже расшифрованные.
  Кстати, сейчас разворачивается большой проект "Structural Genomics", цель которого  —  расшифровать пространственное строение хотя бы одного представителя каждого семейства белков (а их  —  порядка 10000). Когда эта программа будет завершена  —  для этого придется потратить примерно 10 миллиардов $ за 10 лет  —  все предсказание структур "новых" белков можно будет  —  мы надеемся на это  —  делать по гомологии с уже расшифрованными белками. Однако пока что приходится использовать лишь вероятностные методы предсказания; в настоящее время они  —  точнее, лучшие из них  —  дают правильный ответ (для белков, не имеющих видимой гомологии с уже расшифрованными) примерно в 30% случаев.

  Итак, предсказывая структуру белка, не имеющего видимой гомологии с белками уже расшифрованными, можно попробовать взять, одну за другой, все пространственные структуры из Банка, наложить (возможно, с некоторыми выпетливаниями, см. Рис.19-12) цепь этого белка на каждую из них, и посмотреть, какая из этих пространственных структур даст  —  для нашей цепи  —  наибольший энергетический выигрыш. При этом мы должны разрешать цепи то идти по скелету структуры, то выпетливаться или "сокращать" имеющиеся в скелете выпетливания  —  если это увеличивает энергетический выигрыш.
 
 
 

  Рис.19-12. Схема, иллюстрирующая идею "протягивания" исследуемой последовательности по Банку Белковых Структур. Жирная линия показывает те участки, где последовательность идет по скелету, пунктир  —  те, где она выпетливается.
 
 

  Такой подход называют "методом протягивания" (threading method). Он был предложен нами с в 1990 г. и  —  независимо, в более простом и более удобном варианте  —  Д. Айзенбергом и его группой в 1991 г. Сейчас метод протягивания стал весьма популярным методом опознавания структур "новых" белков по их аналогии со "старыми".
  В общем, работа по протягиванию напоминает поиск гомологии,  —  только на этот раз "выравниваются" не две первичные структуры, "новая" и "старая", а "новая" первичная структура со "старым" белковым скелетом.

  Прежде, чем перейти к результатам,  —  хочу подчеркнуть две принципиальные проблемы метода "протягивания". В сущности, аналогичные проблемы, в том или ином виде, возникают в любом "предсказательном" методе.
  Во первых, конформацию даже тех кусков цепи, что наложены на скелет, мы знаем с большой погрешностью: ведь мы не знаем конформации боковых групп,  —  а именно они, в основном, и взаимодействуют. Далее, мы не знаем конформации всех выпетливаний. Оценка показывает, что при протягивании мы знаем примерно половину взаимодействий в белковой цепи, а вторую  —  не знаем. Значит, опять мы вынуждены судить о структуре белка по части взаимодействий, действующих в его цепи. Значит, опять наши предсказания могут носить только вероятный характер.
  Во-вторых, как перебрать все наложения и найти лучшее  —  или лучшие  —  среди них? Ведь их, возможных наложений, страшно много... Скажу коротко: мощные математические вычислительные методы для этого уже развиты, но рассказ об этом занял бы слишком много времени. Наверно, имеет все же смысл назвать эти методы по имени  —  может быть, кому-то из вас пригодится (но большинству, конечно, нет). Итак: динамическое программирование и его вариант  —  статистическая механика одномерных систем (цепных молекул)  —  для расчета протягивания цепи через скелет; теория самосогласованного поля  —  для расчета действующего на цепь молекулярного поля в каждой точке скелета; стохастическая минимизация энергии методом Монте-Карло; а также  —  разные варианты метода ветвей и границ, и т. д.

  Для примера я покажу предсказанную методом протягивания укладку цепи в белке, терминирующем репликацию. Протягивая цепь этого "нового" белка по всем известным трехмерным белковым структурам, Зиппль и его коллеги из Зальцбурга показали, что укладка гистона Н5 наиболее "родственна" этой цепи (Рис.19-13).
 
 
 

  Рис.19-13. Гистон Н5 цыпленка (1hstA, слева) и белок, терминирующий репликацию (rtp, справа); в последнем не показана С-концевая спираль, не имеющая аналога в гистоне Н5. Предсказание сходства укладки цепи в этих двух белках сделано, методом "протягивания", в работе H. Flckner, M. Braxenthaler, P. Lackner, M. Jaritz, M. Ortner & M. J.Sippl, Proteins (1995) 23:376-386; это предсказание сделано в ходе "слепого" тестирования предсказательных методов (CASP-1994). Средне-квадратичное отклонение между 65-ю эквивалентными Сa атомами в изображенных структурах  —  2.4.
 
 
 

  Рис.19-14. Последовательность гистона Н5 (1hstA), выровненная относительно последовательности белка, терминирующего репликацию (rtp) согласно рентгеноструктурным данным ("Наблюдаемая", верхняя пара последовательностей), и она же, выровненная согласно предсказанию методом протягивания ("Предсказанная", нижняя пара). Серыми зонами показаны сдвиги, расхождения этих двух выравниваний. Они хорошо видны по разным сдвигам вторичных структур гистона Н5, приведенных в самой верхней и самой нижней строке в этих двух выравниваниях. Вторичные структуры записаны в подчеркнутых строках (обозначения: Н  —  a-спираль, Е  —  b-тяж, Т  —  изгиб цепи). Точками отмечены делеции, пропуски в первичных и вторичных структурах, внесенные при их выравнивании. Картинка взята из статьи C. M.-R. Lemer, V. J.Rooman & S. J.Wodak, Proteins (1995) 23:337-355, в которой обсуждаются итоги CASP-1994.
 
 

  Таким образом они правильно опознали мотив укладки цепи белка  —  терминатора репликации. Правда, предсказанное (при помощи теоретического протягивания) наложение цепи этого белка на структуру гистона Н5 довольно сильно отличается (Рис.19-14) от того, что получается при прямом наложении трехмерных структур этих молекул. Это еще раз показывает, что все погрешности, о которых я говорил по ходу лекций  —  погрешности в параметрах стабильности, незнание точной конформации петель и т. д.  —  не позволяют выделить одну уникальную наилучшую структуру, а позволяют в действительности только найти более или менее узкий набор лучших структур. Такой набор "лучших" пространственных структур можно выделить довольно надежно; а вот какая из них окажется, согласно расчету, "наилучшей"  —  это дело случая. Нативная структура находится где-то в наборе "лучших" структур, она приблизительно соответствует предсказанной ("наилучшей"),  —  но это все, что можно реально сказать.
  Я, конечно, привел только "хорошие" примеры  —  примеры удавшихся предсказаний. Примеров неудавшихся много больше, и это понятно  —  ведь, предсказывая, надо выбрать один, или пусть несколько вариантов из бездны оцениваемых. Так что попасть рядом с такой бесконечно малой целью даже в трети или в четверти случаев (так сейчас работают наиболее успешные группы),  —  огромный успех.
  Поэтому методы "протягивания" становятся сейчас рабочим инструментом для опознавания трехмерных структур белковых последовательностей. Чрезвычайно важно, что уже сформирован рецепт  —  делай так, так и так, и в результате ты получишь одну или несколько структур, среди которых, с довольно высокой вероятностью, будет структура, сходная с трехмерной укладкой рассматриваемой последовательности.