Електронний посібник до вивчення курсу Клінічна фармакологія та лабораторний супровід для фармакотерпії (стр. 51 )

Атомно-емісійний спектральний аналіз. Широке розповсюдження цього виду дослідження стало можливим завдяки використанню атомно-емісійних спектрометрів (АЕМС). До складу приладів такого типу входять: джерело збудження спектрів, поліхроматор, оптичний (зазвичай багатоканальний) аналізатор і ПЕВМ, що управляє, з комплектом програмного забезпечення. В ході пробоподготовки використовуються доступне допоміжне устаткування і витратні матеріали: електроплитка, муфельна піч і вугільні електроди.

Підготовлена до аналізу проба поміщається в камеру зразка джерела збудження спектру. Під дією електричного розряду аналізована речовина випаровується і його атоми збуджуються в області розряду. Випромінюваний світловий потік за допомогою оптичної системи прямує в поліхроматор, де розкладається на спектральні складові. Обробка спектрів проводиться із застосуванням калібрування по стандартах автоматично: за площею або висотою піків. На все дослідження йде невеликий проміжок часу, наприклад, 5 хв. ПЕВМ управляє поджігом і відключенням розряду, скануванням спектрального інтервалу, реєстрацією спектрів, здійсненням ідентифікації і математичною обробкою отриманої інформації, визначенням концентрації і виведенням результатів. Загальне число визначуваних елементів досягає 50 і більш. НПФ «Люмекс» розроблений аналізатор атомної абсорбції МГА-915, що дозволяє виконувати дослідження без попередньої мінералізації проб.

Імуноферментний аналіз

Після появи перших повідомлень про можливість приєднання молекул ферментів до звичайних білок (Nakane, Pierce, 1966; Avrames, 1969) зусилля дослідників концентрувалися на розробці таких методів кількісного аналізу, в яких би індикатором реакції служила здатність ензимів викликати руйнування субстрата з утворенням зрештою забарвленого продукту. Наприкінці виявилося можливим визначення у такий спосіб IGG і хоріонічного гонадотропіна. В даний час методи імуноферментного аналізу (ІФА) займають важливе місце в арсеналі лабораторій світу. Екологічна чистота, висока специфічність і відтворюваність, можливість використання відносно простій, дешевої апаратури та доступних наборів реагентів відкривають перспективи широкого використання даного методу в медичній практиці. Для кількісного аналізу застосовують в основному два варіанти виконання ІФА. Першим етапом їх здійснення є скріплення моноспецифічних антитіл (або антигена) на поверхні твердої фази. Далі стає можливим проводити реакції конкурентного або непрямого (сендвіч) типу.

У 1-му варіанті методів антиген, що мітиться ферментом, конкурує з неміченим досліджуваним антигеном за антитіла, що містяться на твердій фазі: ферментативна активність виявляється оборотно-пропорційною кількості антигена в досліджуваному зразку.

У 2-му варіанті використання ІФА конкурентні стосунки відсутні: антигени досліджуваної біологічної рідини реагують з імобілізованнимі на твердій фазі антитілами, після чого надлишок суміші видаляють і в реакцію вводять мічені ферментом антитіла, які зв'язуються вже імобілізованним антигеном. В цьому випадку ферментативна активність знаходиться в прямо пропорційній залежності з кількістю антигена в досліджуваному біологічному матеріалі. Як ферментні мітки використовується пероксидаза, лужна фосфатаза, глюкозооксидаза і бета-галактозідаза. При дії ферменту на хромоген утворюється забарвлений продукт, про зміст якого судять по оптичній щільності фотометріруємого розчину.

Принцип твердофазного (плашечного, пробірного, а також на кульках, що вносяться до пробірок, зірочках) імуноферментного аналізу ELISA (Enzyme Linked Immunosoibent Assay) полягає у формуванні комплексу, що нагадує собою «листковий пиріг», в якому визначувана речовина складає один з внутрішніх його шарів, а індикаторний фермент – самий зовнішній. При використанні плашечного твердофазного ІФА визначення виконують в лунках, стінки яких виготовлені із спеціального матеріалу, ефективно адсорбуючого антитіла – полістірена. Спочатку в них вносять первінни антитіла (наприклад, кролячі антитіла проти людського альбуміну), а потім (після їх адсорбції на стінках і видалення надлишку) досліджувану пробу.

Молекули альбуміну через посредство первинних антитіл виявляються фіксованими на стінках лунки. Після цього додають вторинні антитіла (проти людського альбуміну), що фіксуються на тих же альбумінових молекулах, які іншими угрупуваннями адсорбовані на первинних антитілах (ELISA – метод подвійних антитіл). Четвертий шар імунного «пирога» – фермент пероксидаза, фіксований на антитілах, що зв'язуються з вторинними антитілами. При цьому кількість фіксованої пероксидази виявляється прямо пропорційною вмісту альбуміну в досліджуваній пробі. Після додавання кожного реагенту та завершення реакції скріплення надлишок білків ретельно видаляють відмиванням буферним розчином. На кінцевому етапі визначення проводять ферментативну реакцію, для чого в лунку додають о-фенілендіамін і перекис водню. Завдяки присутній пероксидазе о-фенілендіамін окислюється, і через деякий час інтенсивність забарвлення вимірюється фотометрично.

Імуноферментний тест типу ELISA останніми роками широко використовується для визначення різноманітних біологічно важливих речовин, зокрема ЛП(а). Реакція здійснюється у декілька етапів. Спочатку в досліджувану сироватку (плазму) крові додають антисироватку, що містить надмірну, але строго визначену кількість анті-ЛП(а). В результаті взаємодії ЛП(а) і анті-ЛП(а) утворюються імунні комплекси, які віддаляються з розчину. Далі антисироваткою, що містить залишок анті-ЛП(а), обробляється поверхня внутрішньої стінки пробірки, плашки полістиролу, в осередках якої знаходиться антиген ЛП(а). На наступному етапі антитіло взаємодіє з кон'югатом – імуноглобуліном, пов'язаним з ферментом пероксидазой. Під впливом останньою відбувається розкладання субстрата, що супроводиться появою забарвлення вмісту лунок, вираженість якої реєструється спеціальним фотометром, що дозволяє оцінити концентрацію визначуваної речовини.

Автоматизовані пристрої для виконання імуноферментних досліджень

Фірмою «Берінгер Маннгейм» пропонується лабораторне устаткування для МФА, що використовує принцип ELISA та технологію твердофазной пробірної техніки. В імуноферментному аналізаторі Es-33 перша операція – піпетіровання виконується ручним способом (внесення проби та інкубаційного буферу). Решта всіх робочих операцій, тобто промивка, піпетіровання, побудова калібрувальної кривої та розрахунок результатів, виконується автоматично. Імуноферментний аналізатор Es-300 – повністю автоматизований багатоканальний аналізатор, адаптований до реактивів фірми «Берінгер Маннгейм», дозволяє виконувати більше 40 імуноферментних тестів, зокрема визначати гормони (дослідження окремих ланок системи, що забезпечує функціональну активність щитоподібної залози), онкомаркери, маркери інфекційних захворювань. Стрептавідін-біотінове покриття внутрішньої стінки пробірок дає можливість здійснювати високоспецифічне та високочутливе визначення. Тривалість дослідження складає від 1–2 до 4 годин. Можливе проведення дослідження в режимах «по серіях на кожну методику» і «по серіях на пацієнтах». При дослідженні по одному параметру за один робочий цикл може бути виконане до 150 аналізів, при дослідженні по 2 параметрам – до 75, по 3 – до 50 і так далі Якщо ж реагент виявляється багатокомпонентним, то кількість аналізованих проб, досліджуваних за один цикл роботи приладу, ще більш зменшується. На часі отримання результатів позначається і відносна тривалість попередньої підготовки приладу до роботи.

У клініко-лабораторной практиці широко використовуються устаткування та тест-системи фірми «Хоффманн-Ла Рош», що дозволяють реалізувати «сендвіч» – метод. Для вивчення імунного статусу організму фірмою «Хоффманн-Ла Рош» пропонуються: повний імуноферментний аналізатор «Cobas Core», напівавтоматична система «Е1а», а як реагенти – добре адаптовані до згаданих аналізаторів набори реактивів «Діаплюс («Рош-Москва»).

Автоаналізатор імунохімії «Cobas Core» (розміщуваний на звичайному лабораторному столі) призначений для лабораторій, що виконують 10–20 тисяч аналізів за рік. Продуктивність – 150 досліджень за годину, тому прилад доцільно використовувати в крупних клініко-діагностичних лабораторіях, медичних діагностичних центрах, багатопрофільних лікарнях, на станціях переливання крові. Для проведення аналізу до пробірок вносяться кульки полістиролів з імобілізованимі на їх поверхні антитілами. Завдяки такій технології стає можливим виконання не тільки масових, але і одиничних досліджень. Весь технологічний процес – внесення реагентів, пре - і построзведення зразків, промивка, інкубація, фотометрування, обробка результатів – повністю автоматизовани. При цьому зберігається можливість виконання екстрених досліджень без переривання поточного процесу. Перший результат аналізу після включення приладу може бути отриманий вже через 30–120 хв (залежно від визначуваних тестів). Автоаналізатор легко перемикається на режими дослідження «по тестах» і «по пацієнтах». Прилад добре адаптований не тільки до порівняно дешевих наборів реагентів «Рош-Москва» («Діаплюс»), але і до всіх інших, що призначається для пробірного аналізу. Автоаналізатор дозволяє програмувати визначення 80 маркерів, використовуване для діагностики численних онкологічних (онкомаркери), вірусних (ретравіруси) захворювань, ВІЛ – інфекції, гепатитів, порушення функції генеративних органів, виявлення алергічних станів, визначення функції щитоподібної залози (тиреоїдна діагностика), виконання серологічних досліджень (діагностика токсоплазмоза), встановлення факту вагітності (тести на фертильність).

Система для імуноферментного аналізу «Cobas EIA Sistem» може бути застосована при меншій потребі у виконанні імунологічних досліджень. Вона складається із інкубатора на 100 пробірок, промивача (для одночасної промивки 25 пробірок) і 25-канального фотометра (продуктивністю 2500 проб за годину). ІФА–система здатна забезпечити виконання до 400 визначень за годину.

Автоматизовані імуноферментни аналізатори фірми «Serono Diagnostics»: «Sr-1», «Serosime I і II». Використовуються для визначення трийодтироніну (загального, вільного, реверсивного), тіроксина (загального та вільного), тиреотропіну, прогестерону, пролактіну, загального та вільного естрадіолу, фолікулостімулюючого гормону, хоріонічного гонадотропіна, лютеїнізуючого гормону, кортизолу, феритину, імуноглобуліну (загального), альфафетопротєїну, карциноембріонального антигену, дігоксину, дигітоксину.