Електронний посібник до вивчення курсу Клінічна фармакологія та лабораторний супровід для фармакотерпії (стр. 52 )

Дослідження, що виконуються імуноферментним методом з використанням моно - і поліклональних антитіл, технології твердофазного магнітного розділення компонентів, що не зв'язалися та колориметричного визначення ферментативної активності для кількісної оцінки досліджуваних показників. Реагенти, необхідні для визначення конкрет-ного тесту, а також калібратор розміщуються в спеціальному картріджі (зберігаються при температурі 2–8°С). Загальні реактиви, використовувані для всіх тестів, розміщуються в приладі (одна упаковка розрахована на «обробку» 90 картріджів).

Фотометричні вимірювання виконуються в спеціальному вимірювальному осередку при довжинах хвиль 490 (492) /550 (554) /630 (650) нм. Прочитування виконується в стандартних скляних і пластикових пробірках. Управління приладом здійснюється за допомогою клавіатури, захищеної спеціальним покриттям, що перешкоджає проникненню рідини, пилу та інших забруднень. Введення інформації про картріджи досягається за допомогою считивателя баркодов (Sr-1). Заливки 250 мкл/яч – не більше 50 с; кількість циклів промивки – до 10; час відмочування – 30 – 300 с.; підтрушування за допомогою багатопланшетного підтрушувача «Сигма-1».

Вимірювальний комплекс, що включає спектрофотометр, отмивочний пристрій і підтрушувач, серійно випускається підприємством «Нуклон».

Сімейство аналогічних мікроплашечних аналізаторів «Multiskan» фірми «Лабсистема» включає:

– фотометр серії «Multiskan»: «Multiskan Plus», «Multiskan Bichromatic», «Multiskan Mcc/340», «Multiskan Multisoft»;

– промивач (автоматичний 8- або 12-канальний вошер) – «Multiwash»: використовує 96-лункові плашки, легко калібрується для U-, V - або плоскодонних плашок; має в своєму розпорядженні 7 різних програм промивки;

– інкубатор/шейкер (Incubator/shaker): пристрій, що поєднує в собі властивості інкубатора та підтрушувача (інтервал температури 14–40°С, час прогрівання до встановлення температури 24–37°С менше 20 хв., п'яти швидкостей струшування); підтрушувач двох або чотирьох планшетів;

– 96-лункові плашки; розбірні мікростріпи, що дозволяють використовувати тільки необхідну для аналізу кількість лунок;

– ЕОМ, до якої аналізатор може бути підключений для збору та обробки даних;

– одноканальні та багатоканальні цифрові піпетки – на 4, 8, 12 наконечників («Фінпіпет»); багатоканальні піпетки із змінним об'ємом; багатоканальні крокові диспенсери, наконечники одноразового користування;

– комплект реактивів для імуноферментного аналізу. Для проведення плашечного імуноферментного аналізу фірма «Органон техніка» пропонує спеціальне устаткування (спектрофотометри, промивачі мікропланшет, інкубатори) – від простих напівавтоматичних приладів до повністю автоматизованих комплексів–роботів. Лабораторіям зі середнімі об'ємами виконання досліджень пропонуєтся повністю автоматизований комплект «Reader 530», промивач «Washer 4w», інкубатор «Incubator 500», багатоканальні піпетки та принтер. Комплект може доповнюватися програмним забезпеченням MIMS – Microplate Information Managment Software, яке управляє апаратним комплексом, дозволяє проводити облік і оцінку результатів і підтримує оперативну обробку бази даних. Устаткування є відкритою системою. Фірма «Органон техніка» випускає ІФА–системи для діагностіки ВІЛ, вірусних гепатитів (А, В, С, D), маркерів сифілісу, цитомегаловірусной інфекції, краснухи, токсоплазмоза та ін.

Імуноферментни аналізатори широко використовуються в різних областях медицини: клінічной та експріментальной вірусології, мікробіології, біохімії, імунології, токсикології, фармакології; для контролю технології виробництва в медичній, харчовій і мікробіологічній промисловості; сільському господарстві та ветеринарії; для контролю за навколишнім середовищем. Завдяки використанню твердофазного плашечного ІФА здійснюється рання діагностика вагітності, пренатальний скринінг вроджених вад розвитку, рання діагностика онкологічних захворювань шлунково-кишкового тракту, підшлункової залози, жіночої репродуктивної системи; виявляється схильність до цукрового діабету, патології щитовидної залози; це досягається визначенням численних гормонів в сироватці (плазмі) крові.

Імунофлюоресцентний аналіз і апаратура, використовувана для його здійснення

Метод імунофлюоресценції розроблений Coons et al. (1941), що довели можливість приєднувати флюоресцентні фарбники до молекул імуноглобулінів без порушення їх специфічної активності. У цьому виді аналізу як індикатори при визначенні антигенів і антитіл використовуються флюоресцентни речовини. Для лабораторної діагностики застосовуються різноманітні варіанти иммуно-флюоресцентного аналізу: поляризаційно-флюоресцентний; що базується на принципі як «гасіння» флюоресценції, так і посилення її; твердофазная флюоресценція, електрохемілюмінесценція. Перші три методики призначено для прямого визначення флюоресцентних речовин без їх виділення з реакційного середовища. При твердофазном же імуноферментном аналізі виникає потреба в попередньому видаленні продуктів реакції, що створюють фонові перешкоди. Суть процедури визначення речовин методом твердофазной флюоресценції зводиться до того, що спочатку облягають антитіла на твердому носієві: наприклад, на стінках пластикових пробірок або шарах «латексу» полістиролу, що вносяться до досліджуваної сироватки (визначення альфа-фетопротеїну). Потім пробу центріфугуют і зливають рідину, що містить компоненти реакції. Після цього додають мічені флюоресцєїном антитіла, проводять реакцію скріплення, надлишок матеріалу видаляють відмиванням і заміряють флюоресценцію. Методи електрохемілюмінесцентних досліджень базуються на здатності рутенію, осмію, ренію та інших речовин утворювати високо-реакційні з'єднання на поверхні електроду. Хемілюмінесцентна реакція ініціюється додатком електричної напруги до імунного комплексу, що містить рутеній, пов'язаного з покритими стрептавідіном магнітними частинками. До складу імунного комплексу входять визначуваний антиген і два моноклональні антитіла, одне з яких мічено рутенієм, а інше пов'язане з біотіном, що забезпечує взаємодію всього імунного комплексу з магнітними мікрочастками, покритими стрептавідіном. Завдяки можливості циклічного посилення сигналу забезпечується лінійний режим вимірювання у вельми широкому діапазоні, що охоплює зміни концентрації на 6–8 порядків. Це дозволяє виключити розведення проб і значно скоротити час аналізу (до 9–18 хв після пілотування). Апаратура, потрібна для реєстрації флюоресценції, поставляється фірмами Фінляндії (прилади «Fluoroskan», «Luminoskan» фірми «Лабсистемс»), Чехії (люмінометрічна система «Luminometric systems Liana» фірми «Іммунотех»), Франції (автоматизована система для іммуноферментного аналізу по «ЕЛЬФА», здійснювана на компактному автоматичному аналізаторі – «minividas»), США (устаткування для флюоресцентно-поляризаційного імуноаналіза – Imx, Tdx).

Хемілюмінесцентни імунодіагностічни набори («Liana» – ILMA), що призначаються для використання в ендокринології (визначення гормонів щитоподібної залози та ін.), онкології (онкомаркери) та інших областях медицини, випускаються фірмами «Імунотех», «ДІАМ Інтернешнл».

У люмінометрічной системі «Liana» використовується принцип іму-нометрічного дослідження з реєстрацією результатів по величині посиленої в ході реакції люмінесценції. Аналізовані зразки та стандарти інкубують в непрозорих (білих) лунках, покритих специфічними моноклональними антитілами. Кон'югат других моноклональних антитіл (ILMA) або антиген (LIA) з пероксидазой хріну інкубують разом із зразками. Після цього осередки планшета промивають, видаляючи незв'язаний кон'югат, а в лунки вносять сигнальний реагент. Світловий сигнал реєструють з використанням люмінометра, «liana» або іншого приладу, здатного вимірювати інтенсивність світла, випромінюваного лунками мікропланшета (наприклад, «Amerlite»). Результати інтерпретують за допомогою комп'ютерної програми «Liana».

У медичних установах України знайшла застосування також і автоматизована система для проведення імуноферментного аналізу по «Ельфа»–технології на аналізаторі «minividas» (фірми «Біомерье»). Особливістю приладу є введення калібрувальних кривих за допомогою штріх-кода, що значно спрощує експлуатацію автоаналізатора. У двох секціях його можуть бути одночасно розміщені 12 пластинок, що призначаються для проведення досліджень. У кожній з них є осередки з вже готовими для використання реагентами. Реакція проводиться після внесення в них досліджуваної сироватки (плазми) та початку контакту із спеціальним конусом, що містить моноклональні антитіла (для чого натискається кнопка «Старт»). Результат може бути отриманий через 30–90 хв. Фірмою пропонуються діагностичні набори для проведення не тільки кількісного, але і якісного (скринінгового) визначення, що здешевлює виконання досліджень. Для проведення імунного аналізу за електрохемілюмінесцентной технологією використовуються автоматичні аналізатори «ELECSYS 1010», «ELEC-SYS 2010» та набори реагентів фірми «Рош діагностиці», що дозволяють одночасно виконувати без постановки дублюючих проб до шести (1010) і п'ятнадцяти (2010) досліджень з продуктивністю 60 (1010) і 80 (2010) аналізів за годину. Ідентифікація реагентів, калібраторів і аналізованих зразків здійснюється за допомогою штріх-кода. Всі використовувані тест-системи, розроблені на основі стрептавідін-біотінової технології із застосуванням рутенієвої мітки, володіють вельми високою стабільністю. Призначаються для діагностики онкологічних, інфекційних захворювань, анемій, інфаркту міокарду, оцінки репродуктивної функції, виявлення гінекологічних захворювань і поразок щитоподібної залози.

Аналіз, що грунтується на використанні полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР - технологія)

ПЛР-технологія – це сучасний, перспективний лабораторний метод дослідження, заснований на використанні полімеразної ланцюгової реакції. Завдяки застосуванню ПЛР-технології вдається виявити та відтворити мільйони копій тієї ділянки ДНК, яка належить хвороботворному агентові, наприклад, збудникові вірусних і інфекційних захворювань, що упровадився в організм людини, тобто здійснити аналіз на генетичному рівні. Якщо «ключова послідовність» ДНК вірусу, бактерії, іншого збудника захворювання відома, то способом штучного синтезу можна отримати органічну речовину (праймер) з комплементарною послідовністю азотистих підстав, що забезпечує здатність прикріплятися до однієї з ниток ДНК в строго певному місці.