Електронний посібник до вивчення курсу Клінічна фармакологія та лабораторний супровід для фармакотерпії (стр. 53 )

Такий «праймер» – копія невеликої (відповідного 20–30 азотистим підставам) ділянки ДНК – є своєрідним «стартовим блоком», з якого під впливом ДНК–полімерази відбувається подовження ланцюга, комплементарного азотистим підставам нитки материнської ДНК. Для подовження ланцюга використовуються азотисті підстави (мононуклеотиди) і інші компоненти, що вводяться в реакційну суміш. Новоутворений ланцюг наполовину складається з нативної (оригінальною) нитки ДНК і наполовину – з новоутвореної, комплементарної (обидві нитки складають половинки «сходів» ДНК). Якщо властива праймеру послідовність азотистих підстав характерна тільки для вірусу, що знаходиться в клітці людини, то, не дивлячись на величезну кількість властивого людині генетичного матеріалу і малу кількість ДНК вірусу («голка в стозі сіна»), буде створений відрізок комплементарного ланцюга, характерний тільки для хвороботворного агента. Для виявлення, наприклад, вірусу досить, щоб в пробі містилася ділянка ДНК збудника з двомастами парами підстав. Відбувається як би відшукання голки в стозі сіна («голка» – це ділянка ДНК вірусу, а «стіг сіна» – сотні мільярдів азотистих підстав нитки ДНК клітки). Надалі створюються спеціальні умови, необхідні для розділення отриманих нових спіралей ДНК на дві нитки. В результаті замість однієї ключової послідовності отримують дві такі самі. Даний процес повторюється знов і знов. У другому циклі кількість ниток ДНК збільшується до чотирьох, оскільки кожна з двох дасть по дві нові ключові послідовності. За 25 циклів, що повторюються, проводяться мільйони копій ДНК. Для розвитку реакції достатньо наявності в пробі 10–30 молекул хвороботворного агента, сама ж ланцюгова реакція стартуєтся 3–5 дублями ниток, присутнимі в пробі. Весь технологічний процес дослідження з використанням полімеразної ланцюгової реакції здійснюється в три етапи: підготовка зразка; проведення самої полімеразної реакції, направленої на множення (ампліфікацію) фрагментів ДНК біологічного збудника захворювання; оцінка результату.

На першому етапі зразок, що містить ДНК хвороботворного агента, вноситься до невеликої пробірки, що містить компоненти що забезпечують протікання полімеразної реакції: два вида праймерів, два ензими (таг-полімераза і N-урацилгліколаза) і чотири види нуклеотіда А, З, G і Y.

На другому етапі для виконання полімеразної реакції використовується спеціальний пристрій (термоциклер, або циклотермостат, ДНК-ампліфікатор) з автоматичною зміною температурного режиму в приладі. У першому циклі здійснення ПЛР аналізований зразок нагрівається (приблизно до 94°С) для розділення двох комплементарних ниток ДНК (денатурація). Потім температура опускається до 40–60°С – температури, при якій праймери прикріпляються до одиничного ланцюга ДНК, після чого температура знов піднімається, доходячи до рівня 72°С (при якій найбільш виражена активність полімерази). Весь цикл, пов'язаний із зміною температури, продовжується менше 3 хв. Він повторюється 20–30 разів. Результати ПЛР аналізуються з використанням методу імуноферментного аналізу, електрофорезу в поліакріламідном, плоскому агаровому гелі. Відповідно до методології фірми «Хоффманн-Ла Рош» вміст пробірок, що витягують з термоциклера, переноситься в лунку спеціальної планшети. На дні лунки міститься фіксований до внутрішньої її поверхні BSA, здатний зв'язуватися з копіями ниток ДНК. Після інкубації невикористані компоненти реакції віддаляються з водою. Для кількісної оцінки реакції додається авідін-ензімний комплекс. Після подальшого відмивання та додавання певних реагентів розчин приймає характерне забарвлення, інтенсивність якого реєструється фотометрично. Основними перевагами ПЛР є: швидкість виконання аналізу, висока чутливість і специфічність. ПЛР знаходить застосування для виконання як фундаментальних (генетичних, тіпірованія тканин), так і прикладних, клініко-лабораторних досліджень: діагностика ВІЛ-інфекції; захворювань, що викликаються бактерійною мікрофлорою (туберкульоз, атипова пневмонія, гонорея, сифіліс, менінгіт, гастрит, дизентерія, тіфоїдна лихоманка), простішимі (амебна дизентерія, токсоплазмоз і ін.), грибами (кандидоз і ін.), а також для виявлення системної інфекції (гепатит В/С), вірусу імунодефіциту людини (Hiv1/hiv2), людської Т-клеточной лейкемії, папіломи. ПЛР може бути використана для виявлення одиничних, точкових мутацій (пов'язаних із заміною однієї азотистої підстави на інше). Маєть велике значення в реалізації цієї технології в області здійснення «проекту людського генома».

Сатураційний аналіз: принцип, методологія та технологія виконання радіонуклідних досліджень – радіоімунологічного аналізу (РІА), імунорадіометрічного аналізу (ІРМА)

«Сатураційний» (що насичує) аналіз – вид дослідження, що грунтується на конкурентному пов'язанні деяких речовин (лігаццов) із аналізованою речовиною біологічного походження та його міченим аналогом, доданим ззовні. Вони конкурують за ліганд, який використовується в такій кількості, щоб його зв'язуюча здатність повністю наситилася. Очевидно, що чим більше в пробі визначуваної речовини, тим менше зв'язується мічена речовина. Після цього відокремлюють комплекс від вільних інгредієнтів і підраховують кількість влучні, визначуваною як у складі комплексу, так і поза ним. Як лігандов використовуються три групи речовин біологічного походження: антитіла, специфічні транспортні білки, рецепторні білки органів-мішеней. Особливість методу конкурентного скріплення («сатураційний аналіз») полягає в тому, що використовувані в нім ліганди мають виключно біологічне походження; мічену ж сполуку отримують з природного, приєднуючи до нього радіоактивну (або іншу) мітку у вигляді окремого атома або хімічного угрупування. Важливим різновидом сатураційного аналізу є радіонуклідний, такій, що базується на застосуванні з'єднання з радіоактивною міткою.

Залежно від природи зв'язуючого акцептора прийнято розрізняти:

а) істинно радіоімунологічні методи, в яких як зв'язуючий компонент (ліганда) використовуються специфічні до досліджуваної речовини антитіла;

б) методи белковоконкурентного аналізу, де зв'язуючим реагентом є специфічні білки сироватки крові (транськортін, трансферин, тіроксинзв'язиваючий глобулін; глобулін, що зв'язує тестостерон, і т. д.). Їх здатність до комплексування з транспортними білками зберігається і в пробірці;

в) методи радіорецепторного аналізу, в яких як акцептори використовуються тканинні білки.

Розрізняють наступні основні види радіонуклідного аналізу:

1. Радіоімунологічний аналіз. Вперше запропонований Ялоу і Берсоном в 1960 р. для визначення змісту ендогенного інсуліну в плазмі крові людини. Заснований на реакції імунохімії антигена зі специфічним антитілом: проводиться in vitro у присутності відповідного міченого радіонуклідом з'єднання. Визначувана речовина є антигеном, а радіоактивним індикатором служить мічений антиген. При оптимальному підборі концентрації основних реагентів і умов проведення реакції відбувається конкурентна реакція міченого і не міченого антигена з певною кількістю специфічного антитіла. Після досягнення рівноваги вільний антиген відділяється від антигена, пов'язаного з антитілом. Ступінь конкурентного інгібірування процесу скріплення міченого антигена в дослідних (невідомих) зразках порівнюють із такою в калібрувальних розчинах з відомою кількістю не міченого антигена та по калібрувальній кривій визначають кількісний вміст досліджуваної речовини в аналізованій пробі. Велика спорідненість і висока специфічність антитіл у поєднанні з точністю та чутливістю сучасних радіоіндикаторних методів служать гарантією надійності радіоімунологічного аналізу. Разом з класичним радіоімунологічним аналізом, що проводиться в гомогенній фазі (у розчині), застосовуються різні варіанти так званого «твердофазного радіоімунного аналізу», при якому антитіла фіксовані на твердій фазі (на імуносорбентах).

Імунорадіометрічний аналіз відрізняється від радіоїмунологичного тим, що як мічений реагент використовується антитіло, а антиген (як калібрувальний, так і аналізований) є нерадіоактивним компонентом реакції.

Радіоконкурентний аналіз базується на конкурентній взаємодії між досліджуваною речовиною, його міченим аналогом і зв'язуючим компонентом, як який використовуються специфічні білки плазми (тіроксинозв'язиваючий білок при визначенні тіроксина та ін.). Слід зазначити, що в порівнянні з радіоімунологічним аналізом радіоконкурентний (білковоконкурентний) володіє меншою чутливістю та нижчою специфічністю.

Радіорецепторний аналіз – метод, при якому в якості специфічно связиващего компоненту реакції застосовується тканинний рецептор (тобто клітинний зв'язуючий білок), а як радіоіндикатор – мічений ліганд. Велике практичне значення мають «зворотні методи», що полягають у визначенні концентрації рецепторів в тканинах, наприклад естрогенних рецепторів в пухлинних тканинах. Перевагою радіорецепторного аналізу є те, що отримані результати тісно відображають біологічну активність досліджуваних речовин.

Радіоензиматичний аналіз – спосіб, в якому як зв'язуючий реагент для визначуваної речовини та його міченого похідного (радіоіндикатора) використовується специфічний фермент. Характерною особливістю радіоензиматичного аналізу є його висока чутливість. Мітки застосовують не тільки радіоактивний нуклід, але і багато інших речовин, які можна точно зміряти в дуже малих кількостях і які здатні міцно зв'язуватися з молекулою ліганда, не викликаючи помітних змін його властивостей. До них відносяться:

– флюоресцентна мітка: менш чутлива в порівнянні з радіонуклідною і тому дозволяє проводити визначення тих речовин, які містяться в біологічних рідинах в щодо великих концентраціях. Недоліком флюоресцентних методів є високий рівень фону, обумовлений власною флюоресценцією більшості біологічних рідин організму, що може знижувати точність визначення;

– ферментна мітка: метод, що полягає в її використанні, заснований на способності окремих ферментів зв'язуватися (ковалентний) з іншими молекулами, створюючи тим самим основу для отримання мічених сполук. Завдяки високій каталітичній здатності ферментів одна його молекула викликає перетворення великого числа молекул субстрата. По ступеню його руйнування або утворення нових продуктів можна визначати активність ферменту (а отже, зміст аналізованої речовини), використовуючи для цього, наприклад, метод колориметрії;