Оглавление (стр. 57 )

1.6.25. Электрофорез в неводной среде.

¾ В смесях воды и полярных растворителях. Белки плохо растворимы в неводной среде. Несмотря на это, были попытки использовать неводные растворители для фракционирования белков. Коном было осуществлено тонкое фракционирования белков плазмы крови в смесях воды и этанола, которому предшествовали длительные теоретические исследования. Оказалось, что при низких температурах смесь воды и спирта теряет свои денатурирующие свойства.

Денатурирующие свойства неводных растворителей определяются в основном их низкой диэлектрической проницаемостью.

Диэлектрическая константа определяет как силу электростатических взаимодействий и прочность водородных связей, так и гидрофобные взаимодействия. Поэтому распределения сил вдоль полипептидной цепи в воде или в этаноле будут разными, а следовательно, и обе конформации должны различаться между собой.

Диэлектрическая константа веществ повышается при понижении температуры, и для каждого растворителя можно найти условия, при которых она равна 80. Тогда можно наблюдать растворение белков без денатурации в любом растворителе, если сам растворитель не взаимодействует химически с функциональными группами белков.

В настоящее время более исследованными являются водно - этанольные и водно - метанольные смеси, смеси воды с этиленгликолем, пропиленгликолем, метилпентадиолом, метилсульфидом и др.

Влияние температуры на диэлектрическую константу среды можно вычислить по уравнению:

lg e = a - bT,

где a и b - константы, Т - абсолютная температура.

Прежде чем растворять белок, нужно синхронизировать добавку к воде неводного сольвента с понижением температуры до заданного значения диэлектрической константы. Только в этом случае не произойдет денатурации белка. После электрофореза, прежде чем поднять температуру, необходимо удалить неводный растворитель.

Вторая возможность повысить e смеси воды и неводного растворителя основана на способности аминокислот повышать диэлектрическую константу растворителя. Например, водно - этанольная смесь, рН которой поддерживают с помощью глицина, имеет более высокую диэлектрическую константу и в меньшей мере денатурирует белки.

Вклад глицина можно посчитать по формуле:

e = e 0 + De 0 c, (1.6.42.)

где e0 - диэлектрическая константа чистой смеси, e - то же после добавки глицина, De0 - инкремент глицина, зависящий как от вида смеси, так и от температуры.

Некоторые белки нестабильны даже при температуре 4° С, но могут быть выделены и очищены при более низких температурах. К ним относятся, например мембранные белки, цитохром 450, белки микросом и др. В охлажденной до соответствующей температуры смеси воды с органическим растворителем белки не денатурируются, несмотря на то, что среда является более гидрофобной. Устойчивость белка связана с тем, что процесс денатурации эндотермический и равновесие является энтальпийным. Поэтому всякое понижение температуры тормозит денатурацию.

Главными силами, стабилизирующими белок, являются гидрофобные взаимодействия.

Водородные связи с понижением температуры усиливаются.

¾ Электрофорез в неполярных растворителях. Коллоиды и суспензии, находящиеся в неполярной среде, приобретают заряд чаще всего благодаря адсорбции ионогенных веществ, а иногда и засчет ионизации собственных групп.

В жидкостях с диэлектрической константой меньше 10 вообще трудно наблюдать обычные правильные электрофоретические явления. Скорости движения частиц в водной и неводной среде определяются соотношением:

(1.6.43.)

где e - диэлектрическая константа, h - вязкость.

Электрофорез трудно наблюдать в неполярных средах. Повышение напряжения приводит к эффектам, отличным от классического электрофореза. Уже при напряжении 100 В/см начинаются неправильные движения частиц. Одной из причин этого являются нелинейные электрические эффекты.

Нелинейные эффекты связаны с поляризацией частицы в сильном электрическом поле или поляризацией двойного электрического слоя, в результате чего в движении появляется тангенциальная составляющая частицы, искажающая обычную картину электрофореза. Нелинейные эффекты могут вызвать движение незаряженных частиц в электрическом поле. Электромиграционные и диффузионные потоки ионов вокруг незаряженной частицы при наложении поля могут создать сферически симметричный заряд ( поляризацию) и вызвать поступательное движение частиц или их вращение в однородном электрическом поле, при этом в слабопроводящих жидкостях можно наблюдать вращение даже макротел.

Диэлектрофорезом называют движение частиц под влиянием нелинейных эффектов, вызывающих поляризацию частицы в сильном электрическом поле. Особенностью диэлектрофореза является его независимость от знака поля. В результате наложения переменного поля движение частицы происходит в одном направлении, что объясняется линейной зависимостью движения от напряжения и его направленности к одному из знаков. Наведенный диполь меняет свой знак вместе с переменной знака поля, а направление определяется различиями в поляризации частицы и среды.

Теория показывает, что подобное перемещение в переменном поле

возможно и для заряженной частицы.

1.6.26. ЯМР - спектроскопия.

Основы метода. Ядра находятся в атомах, а атомы в свою очередь в молекулах. Молекулы совершают броуновское движение. Поскольку кинетическая энергия молекулы превышает разность между энергетическими уровнями на несколько порядков, не все ядра находятся на самом низком энергетическом уровне. Занятыми оказываются и более высокие уровни. Более низкие уровни заполнены сильнее, чем высокие.

Это незначительное различие в заселенности является решающим для обнаружения уровней. Переменное магнитное поле с равной вероятностью вызывает как адсорбционные переходы, так и эмиссионные, причем никакого преобладающего направления не существует. Если более низкий уровень заселен сильнее, то адсорбционных переходов будет происходить больше, чем эмиссионных, в результате чего поглощается энергия переменного радиочастотного поля. Этот процесс поглощения и можно обнаружить.

Для существования различия в заселении необходим перенос энергии молекулярного движения на спины ядер. Различие в заселенности возникает только в том случае, если после наложения магнитного поля, т. е. с того момента, когда ядра окажутся в магнитном поле, проходит некоторое время. Это время называется временем спин-решеточной релаксации Т1.

Ядра со спиновым квантовым числом I >1/2, кроме магнитного дипольного момента, имеют еще и электрический квадрупольный момент. У этих ядер возможен быстрый перенос энергии ¾ время релаксации очень мало. Слишком малое время релаксации вызывает уширение сигналов поглощения, что нежелательно в спектрах высокого разрешения.

Слишком большое время релаксации также затрудняет наблюдение сигналов поглощения: столь важное для резонанса различие в заселенности уровней при наложении относительно сильного переменного поля выравнивается быстрее, чем его удается обнаружить, ¾ сигнал, как таковой исчезает. Это явление называется насыщением.

Обнаружение индуцированных переходов между ядерными магнитными уровнями с помощью облучения переменным магнитным полем называется ядерным магнитным резонансом. Его впервые наблюдали Пурселл и Блох в 1946г.

За этот период времени было установлено, что при более точном измерении частоты перехода обнаруживаются различия, которые зависят от химического окружения ядра в молекуле ( химический сдвиг ), а также от присутствия других магнитных ядер в молекуле ( спин - спиновое взаимодействие ).

Требования к образцу. Первое необходимое условие для получения ЯМР-спектра ¾ присутствие в образце магнитных ядер. Все атомные ядра с четным числом протонов и нейтронов имеют спиновое квантовое число I = 0, и для них, таким образом, отпадает вопрос о ЯМР.

Спиновые квантовые числа атомных ядер с нечетным числом как протонов, так и нейтронов имеют целочисленные значения в интервале I = 1 - 6. Атомные ядра с нечетным значением атомной массы, наоборот, имеют полуцелые спиновые квантовые числа в интервале I = 1/2 - 9/2.

Количество вещества. Чтобы в спектре получился заметный сигнал, образец должен содержать достаточное количество магнитных ядер.

Необходимое количество вещества определяется следующими факторами:

Видом ядер, по которым нужно снять спектр

Природным или искусственно повышенным содержанием соответствующих ядер

Количеством исследуемых ядер в молекуле

Рабочей частотой и чувствительностью спектрометра.

Растворение. В ЯМР - спектре высокого разрешения отчетливо видно расщепление ядерных сигналов вследствие химических сдвигов и спин-спинового взаимодействия.

Твердые вещества должны быть растворены в таком растворителе, который по возможности не закрывал бы ЯМР-спектра растворенного вещества.

Сигналы труднорастворимых веществ часто лишь едва заметны, т. к. в образце содержится недостаточное количество магнитных ядер. В таких случаях полезно увеличивать объем образца, работать с расплавами или использовать накопитель.

Установление структуры молекул. Несмотря на большую эффективность в изучении строения органических соединений, и в частности белков, метод ЯМР не заменяет, а дополняет данные ИК - и УФ-спектроскопии.

Величины сигналов, значения магнитного поля, при котором они возникают (химический сдвиг ), ширина и площадь пиков и т. д. определяются магнитными и электрическими свойствами как самих исследуемых ядер, так и свойствами атомов, групп атомов и молекул, окружающих эти ядра. Отсюда очевидно, что существует тесная связь между строением вещества и ЯМР-спектрами.

Применение спектроскопии ЯМР высокого разрешения. Наиболее важным параметром спектров ЯМР высокого разрешения является химический сдвиг. Положение линий в шкале химических сдвигов отсчитывают от определенных эталонных опорных сигналов. Эти расстояния выражают либо в единицах напряженности магнитного поля или частоты, либо в более удобных безразмерных единицах d, определяемых равенством:

(1.6.44.)