Оглавление (стр. 58 )

и измеряются в миллионных долях (м. д. ).

В качестве опорного сигнала удобно брать узкий сигнал, удаленный от других линий спектра. Обычно в исследуемое вещество добавляют небольшое количество эталонной жидкости или в качестве эталона используют сигнал от растворителя (внутренний эталон ). Более предпочтительны внешние эталоны, когда эталонную жидкость запаивают в капилляр, который помещают внутрь ампулы с исследуемым веществом. Сдвиги, измеренные относительно тетраметилсилана как внутреннего эталона, часто выражают в t-шкале, определяемой соотношением

(1.6.45.)

где t*-сдвиг относительно Si(CH3)4 в d-шкале.

Определение первичной химической структуры биологически активных молекул. Возможность определения химической структуры сложных молекул основана на следующих положениях.

Место резонансной линии в шкале химических сдвигов характеризует электронное окружение ядра и соответствует определенным химическим группам. Это дает возможность идентифицировать отдельные химические группы в сложных молекулах.

Изучение распределения интенсивностей позволяет установить относительное содержание различных химических групп в молекуле.

Анализ сверхтонкого расщепления линии свидетельствует о характере и расположении ближайших соседей данной химической группы.

Из-за отсутствия единого эталона возможны отклонения в положении химических сдвигов отдельных линий, однако области спектра, соответствующие отдельным химическим группам, хорошо изучены и линии могут быть строго отождествлены.

Как правило, в водных растворах не удается наблюдать характеристических пиков таких групп как карбоксила, карбонилгидроксила, амино-, имино-, амидо-, сульфгидрильной групп, т. к. происходит быстрый обмен протонов этих групп с протонами воды, причем интенсивный пик воды заслоняет значительную часть спектра. Поэтому обычно биологически важные соединения исследуют в растворах D2О и наблюдают при этом необмениваемые с растворителем протоны.

Другой аспект химического строения, решаемый методом ЯМР, заключается в установлении места протонизации в результате ферментативной реакции или обмена протона с растворителем.

Титрование амино - или карбоксильных групп аминокислот в результате протонизации или депротонизации вызывает изменение электронной плотности и сдвиг резонансных пиков протонов, присоединенных к близлежащим атомам углерода; эффект от более удаленных протонов значительно слабее.

Площадь сигнала, химический сдвиг и константы спин-спинового расщепления позволяют также сделать выводы о характере присутствующих таутомеров.

1.6.27. Исследование распределения заряда в биологически активных молекулах.

Изменение электронной плотности влияет на химические сдвиги и дает возможность исследовать распределение заряда в молекуле.

В общем случае, когда химические группы присоединены к ароматическим кольцам, резонанс наблюдается при более низких полях, чем в случае алкилированных, под действием кольцевых токов.

Спектры ЯМР порфиринов отчетливо показывают наличие в кольце большого тока, обусловленного системой p-электронов. Однако простой учет этого тока не мог объяснить разницы, наблюдаемой в химических сдвигах отдельных протонов молекулы. Удовлетворительное объяснение дает гипотеза Полинга. Полинг трактовал углеродный скелет как проводящую электрическую сеть, причем электромагнитное поле считалось пропорциональным площади, заключенной в каждой петле тока, а сопротивление - числу связей.

Электроотрицательные группы, такие, как OH, NH2, C=O, сдвигают резонансные пики в область более низких полей, когда они присоединены к соединениям с открытой цепью, так как уменьшают электронную плотность у магнитного ядра. При присоединении к ароматическим веществам они вызывают сдвиг пиков в противоположном направлении, что можно объяснить нарушением свободной циркуляции электронов по кольцу и, таким образом, уменьшением эффекта наведенного тока кольца.

Исследование конформации. Спин-спиновое расщепление, появление разных сигналов для химически эквивалентных ядер, избирательное применение ширины линии и другие характеристики спектров ЯМР могут дать ценную информацию о конформации молекул.

Были обнаружены корреляции между конформацией белков в растворе и характером их спектров ЯМР. В отличие от низкомолекулярных веществ движение молекулы полимера как целого не может вызвать усреднения локальных связей, достаточного для получения высокоразрешенного спектра ЯМР. С увеличением молекулярной массы, как правило, разрешенность спектра белка ухудшается. При этом нужно учитывать, что степень разрешенности спектра и ширина сигнала ЯМР для полимера в растворе зависят прежде всего от сегментарной подвижности полимерных цепей, уменьшающей диполь-дипольные взаимодействия. В случае глобулярных белков такая подвижность в значительной степени затруднена из-за внутримолекулярных связей. Эти связи приводят к образованию специфической конформации в виде компактной сферы или эллипсоида и для многих белков в нативном состоянии спектр ЯМР вообще не наблюдается.

При различных денатурационных воздействиях отмечается увеличение интенсивности и разрешенности спектра белка. Например для многих белков наблюдается увеличение разрешенности спектров в концентрированных растворах карбамида и в трифторуксусной кислоте, где происходит разрыв внутримолекулярных водородных связей и переход белковой молекулы из a-спиральной конфигурации в беспорядочный клубок. У рибонуклеазы с разрушенными водородными связями окисление дисульфидных сшивок еще больше увеличивает разрешенность спектра. В случае бычьего сывороточного альбумина и альдолазы окисление дисульфидов почти не влияет на характер спектра. Возможно, что этот факт отражает различия в положении дисульфидных связей в этих молекулах.

Взаимодействие между молекулами. При помощи ЯМР по изменению химических сдвигов, ширины линии (~) и значения Т1 можно обнаружить и изучить специфическое и неспецифическое взаимодействие между молекулами.

Водородная связь. Резонансный пик протонов, связанных водородной связью, наблюдается при более низких полях, чем для протонов, присоединенных к тому же атому в отсутствие водородной связи. Это происходит за счет уменьшения в результате электростатического взаимодействия эффективной электронной плотности у протона. Измерение химических сдвигов протонов воды в концентрированных растворах бычьего альбумина показало, что при этом не происходит изменения числа водородных связей по сравнению с чистой водой. Т. к. в бычьем сывороточном альбумине имеется около 40 % гидрофобных остатков, то было предположено, что на гидрофобных частях белка водородные связи молекул воды друг с другом приводят к образованию ориентированных слоев воды.

1.6.28. ЯМР Применение спектроскопии ЯМР низкого разрешения.

Спектроскопия низкого разрешения дает ценную информацию о строении молекул в твердой фазе, позволяя определить положение протона и других ядер, а также исследовать релаксационные процессы, подвижность молекулы и отдельных ее частей.

Основными характеристиками линии ЯМР низкого разрешения являются ширина сигнала, его моменты, форма линии, наличие тонкой структуры.

Спектры ЯМР полипептидов и белков состоят из узкого пика, наложенного симметрично на широкую линию. Узкий пик в основном обусловлен сорбированной водой, при постепенном высушивании образца он уменьшается и почти исчезает. Возможно, что остатки сигнала принадлежат аморфным юбластям белков и полипептидов. Широкая часть сигнала обусловлена кристаллическими участками.

Изменение ширины и структуры линии для кристалла при различных его ориентациях по отношению к внешнему полю позволяет определить локализацию протонов, что трудно достижимо другими методами. Таким образом было установлено, что NH3 - группа в молекуле глицина является правильным тетраэдром, ось которого лежит вдоль C-N - связи, а длина N-H - связи равна 1,0770,01А. Аналогично для ориентированных волокон коллагена удалось показать, что молекулы воды образуют на поверхности коллагена цепочки, ориентированные вдоль направления оси белка.

Список литературы:

1.  Современная органическая химия. Москва:Мир,1981г. 652с.

2.  Физикохимия полимеров. Львов: Вища школа,1985г. 108c.

3.  Попов -функциональная организация белков. Москва: Наука,1992г. 358с.

4.  Белки. Биохимия белковых веществ. Под ред Нейрат и К. Бэйли. Изд-во иностранной литературы,1971г. 844с.

5.  Свойства веществ и строение молекул. Калинин: изд-во КГУ,1982г. 137с.

6.  Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Под редакцией . Москва : Наука, 1967 г. 324 с.

7.  Электрофоретические методы анализа белков. Под ред. . Новосибирск: Наука, 1981г. 120 с.

8.  Ядерный магнитный резонанс в органической химии. Москва: Мир, 1974г. 176 с.

9.  Бахшиев в молекулярную спектроскопию. Ленинград: ЛГУ, 1987г. 215 с.

10.  Минкин строения молекул. Ростов-на-Дону: Феникс, 1997г.
560 с.

11.  , Поздняков -химические методы исследования в органической и биохимии. Москва: Просвещение,1977г. 175 с.

12.  , , Жданов моменты в органической химии. Москва: Химия, 1968г. 244 с.

13.  Астафуров вещества - М.: «Просвещение» 1983г. 160 с.

14.  Карапетьян вещества - М.: «Высш. школа»1976г. 304 с.

15.  Теоретические основы органической химии. М., «Мир», 1973г.- 1055 с.

16.  Пальм в теорию органической химии. М., «Высш. школа» 1974г.- 446 с.

17.  Установление структуры органических соединений физ. и хим. методами. В 2-х томах М., «Химия», 1967. Кн. 1-я 1974г.- 531с. Кн. 2-я 1967г.- 800с.